31 عدد عکس png درختچه با کیفیت بالا - حجم: 67 مگابایت

اختصاصی از فایلکو 31 عدد عکس png درختچه با کیفیت بالا - حجم: 67 مگابایت دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

این مجموعه شامل 31 عدد عکس درختچه با فرمت png و بدون بکگراند می باشند.

22 عدد عکس png آناناس با کیفیت بالا - حجم: 95 مگابایت

اختصاصی از فایلکو 22 عدد عکس png آناناس با کیفیت بالا - حجم: 95 مگابایت دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

این مجموعه شامل 22 عکس با کیفیت بالا از میوه آناناس هست که با فرمت png در اختیار شما قرار می گیرد.

دانلود مقاله بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

اختصاصی از فایلکو دانلود مقاله بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

خلاصه :
کریپتوسپوریدیایی انسان ها یک بیماری روده ای است که معمولاً به علت عفونت در cryptosporidium hominis یا c-parvum به وجود می آید . این بیماری بیشتر از راه دهان – مدفوعی منتقل می شود (آب یا غذا) و اثر اجتماعی – اقتصادی عمده ای در جهان دارد .
عامل اصلی در پیشگیری ، مراقبت و کنترل کریپتوسپوریدیایی ، تشخیص و ویژگی ژنتیکی گونه های عمده و گوناگونی جمعیت ( که ژنوتیپ یا subgenotye هم خوانده می شود ) کریپتوسپوریدیای منتقل شده به انسان است به خصوص اینکه در حال حاضر هیچ شیمی درمانی موثر ضد کریپتوسپوریدیا یا واکسنی وجود ندارد . در این تحقیق ، ما با استفاده از دومین جدا کننده رونویسی داخلی (ITS-2) DNA ریبوزومی هسته ای به عنوان نشانه ژنتیکی ، روش بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) واکنش زنجیره ی پلیمری جفت شده را برای تشخیص سرایت c-parvum, Cryptosporidium hominis یا c.meleagridis بنا کردیم . یک ارزیابی از منحنی ، تغییر پذیرهای داخلی کوچکتر از %1.5 و تغییر پذیری های معیاری داخلی کوچکتر از %3.5 را معلوم کرد . c.parvum , Cryptosporidium hominis و c.meleagridis با استفاده از 143 نمونه DNA ی انگل های کریپتوسپوریدیم که از استرالیایی های مبتلا به کریپتوسپوریدیا گرفته شده به ترتیب در سال های 2,44,97 کشف شدند . منحنی های ذوبی که با حداکثر دمای c°33/0 ± 47/72 درجه و c°45/0 ± 19/74 درجه سانتی گراد ( نمودار1) ، c°32/0 ± 17/72 (نمودار 2) و c°03/0 ± 33/73 (نمودار3) مشخص می شوند به طور ژنتیکی به ترتیب به عنوان c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شناخته می شوند . در نتیجه ، بررسی ذوب PCR جفت شده ی ITS-2 باعث تشخیص c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شد . این راه مناسب ترین راه برای آزمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگلی کریپتوسپوریدیم است و اگر چه کیفی است نسبت به بررسی الکتروفورتیک به طور قابل توجهی زمان کمتری برای اجرا می گیرد و مزیت افزوده ذخیره ی اطلاعات و قابلیت آنالیز در سیلیکو را نیز دارا می باشد . این روش ابزار مناسبی برای بررسی همه گیری و شیوع کریپتوسپوریدیا را در اختیار می گذارد و قابل اجرا برای انواع دیگر کریپتوسپوریدیا به جز آن هایی که در این جا بررسی شد ، می باشد .

1. مقدمه :
کریپتوسپوریدیای انسانی معمولاً یک بیماری روده ای است که توسط انواع کریپتوسپوریدیا ایجاد می شود و به وسیله راه های دهانی – مدفوعی منتقل می شود [1] . این بیماری به طور ناگهانی اتفاق می افتد [2و3] اما عموماً به دوران کودکی – مراکز مراقبت مربوط می شود و از استخرهای شنا یا آب های نوشیدنی منابع سرایت می کند . [4-9] . بحث دوم که مهم است ، این است که انگل های اولیه Cryptosporidium در مقابل مواد ضد عفونی کننده مثل کلر که عموماً برای پاکسازی آب استفاده می شود ، مقاوم هستند [10-12] . شیوع های از راه آب که از کشورهای توسعه یافته مثل آمریکا و کانادا گزارش شده اند و قابل توجه ترین آن که در سال 1993 در Milwaukee اتفاق افتاد منجر به 5000 مورد تایید شده و بیش از 400،000 مورد مشکوک به کریپتوسپوریدیا شد [4و5و13و14] . به علت حالت جهندگی انگل ها در آب و محیط [15] ، هزینه نسبتاً بالا و دسترسی محدود به ترکیبات شیمیایی یا رژیم های درمانی یا واکسیناسیون در انسان ها و دیگر حیوانات [16-20] و اثر اجتماعی – اقتصادی آن ( مخصوصاٌ در جوامع انسانی که در آن ایدز / HIV شایع است ) . کریپتوسپوریدیا توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان یک عامل بیماری زا که کیفیت آب را نشان می دهد ، رده بندی شد [12] . تشخیص قاطع کریپتوسپوریدیا در انسان ها که شامل شناسایی و تشریح خصوصیات انواع کریپتوسپوریدیا است ، عامل اصلی در کنترل این بیماری و فهمیدن عواقب همه گیری آن است . محدودیت های قابل توجهی با بکارگیری روش های سنتی ، میکروسکوپی ، بیوشیمیایی و سرم خونی برای تشخیص قاطع وجود داشته اند به طوری که ابزارهای ژنتیکی – مولکولی پیشرفته شناسایی و توسعه یافته اند [22] . با استفاده از این ابزارها در حال حاضر ، بیش از 18 نوع کریپتوسپوریدیا و تعداد زیادی ژنوتیپ شناخته شده است [6و23و24] که c.hominis و c.parvum نوع غالب آن ها هستند و در انسان ها پر اهمیت ترین هستند ( به جز تعداد معدودی ، بقیه انواع هم اغلب به این دسته تعلق دارند ) ( مثل [26-28] ) . ابزارهایی که بر مبنای وواکنش زنجیره ی پلیمری (DCR) هستند به طور گسترده ای به کار گرفته شده اند ، چون حساسیت آنها گسترش خاصی از مکان ژنتیکی را از مقدار ناچیزی از مواد انگلی مجازی دارد [29] . مکان های مختلف که شامل واحد تبعی کوچکی [667] از فضاگیرهای RNA ریبوزومی هسته ای و DNA ی ریبوزومی (rDNA) ، پروتئین چسبناک مربوط به ترومبوسپونوین (trop) ، پروتئین شوک حرارتی (hsp70) 70KDa و ژن های پروتئین دیواره انگلی کریپتوسپوریدیا (cowp) می شود ، برای شناسایی و اختلاف بین انواع کریپتوسپوریدیا و متغییرهای ژنتیکی ( ژنوتیپ و ژنوتیپ وابسته) به کار گرفته می شوند [22] . اخیراً ، PCR جفت با روش های پویش جهشی الکتروفوز ترکیب شده با زنجیره ی DNA ، برای این هدف به کار گرفته می شوند [30-31] . برای مثال ، برای غلبه بر محدودیت هایی که در آنالیز تغییر پذیری متوالی در حین فرآورده های PCR وجود داشت پولیمر فسیم ( چند ریختی بودن ) ترکیبی تک استانداردی (sscp) ، برای نمایش مستقیم اختلاف ژنتیکی در hsp70 , SSU و دومین فضاگیر داخلی رونویسی (ITS – 2) هسته ای rDNA ی c.hominis و c.parvum معین شدند [30-36] . مزیت های این روش های الکتروفورزی (مثل خاص بودن ، حساسیت و قابلیت تکثیر کم و زیاد ) از میان نتایجی که از مقایسه مستقیم یک روش SSCP با تعدادی از روش های مختلف مولکولی که برای توصیف ویژگی های ژنتیکی یک نوع کریپتوسپوریدیای انتخاب شده بدست آمد ، اثبات شد [37] . اگرچه این روش بسیار مفید و موثر است ولی آنالیز الکتروفورزی ، در بعضی موارد ، می تواند وقت گیر باشد .
به علت نیاز افزوده به تشخیص با بازده بالا و بررسی ژنتیکی عامل بیماری و نیز جا به جایی اطلاعات ، بررسی ذخیره سازی در سیلیکو ، توجه قابل ملاحظه ای روی ارزیابی و گسترش روش های مرور جهش وجود داشته است که به مشخصه های ذوب امپلیکن ها و آنالیز الکتروفورزی گریزی وابسته است . این روش که خصوصاً برای آنالیز منحنی ذوب با تکنیک بالا (HRM) و منحنی ذوب مبتنی بر RCR به کار می رود ( مثال [38-41] ) و به طور قابل توجهی زمان مورد نیاز برای آزمایش را کاهش می دهد ، می تواند به سرعت بالای آشکارسازی جهش برای امپلیکن های کوچک ( معمولاً bp100 تا 250) برسد [42 تا 45] و منجر به نتایج کیفی و کمی شود . [38و46-49] . در این تحقیق ، روش کاربردی آنالیز منحنی ذوب PCR جفت شده ارزیابی و بنا شد ، ITC – 2 به عنوان ژنتیک ساز برای آشکارسازی نوع غالب کریپتوسپوریدیای سرایت شده به انسان به کار گرفته شد و در مورد دلایل این روش تشخیصی- مولکولی بحث شد .
2- مواد و روش ها
2.1 نمونه ها و جداسازی DNA ژنومی
نمونه های مدفوعی (143 =n) از بیماران مبتلا به کریپتوسپوریدیا از استرالیا جمع آوری شدند . تشخیص کوپرولوجیکی کریپتوسپوریدیا بر اساس آشکارسازی انگل ها با استفاده از روش لکه دار کردن اصلاح شده ذیل – نیلسن ایجاد شده [50] . DNA ژنومی همان طور که توسط مورگان و دیگران توصیف شده از نمونه های مدفوعی استخراج شد [51] . در اصل ، نمونه های مدفوعی فردی در محلول نمک بافر فسفات (PBS) معلق بودند (1:4) . سوسپانسیون ( محلول ) یکدست و یکنواخت شده و lµ20 از آن بیرون کشیده شد و به lµ80 از (pvpp) (sigma) پلی پیرولیدرن پلی دینل %10 معلق در H2O اضافه شد . بعد از اضافه شدن PVPP ، نمونه ها برای 10 دقیقه در دمای c°100 حرارت دیدند و سپس برای 30 ثانیه در kg 10،000 سانتریفیوژ شدند . بعد از سانتریفیوژ ، هر یک از ذرات شناور به یک لوله جدید منتقل شد و کل DNA با استفاده از mini-column (Qiagen,copro-kit,Germany) براساس دستورالعمل سازنده جداسازی شد . نمونه های DNA ژنومی قبلاً براساس PCR ترتیب دهی شده با SSCP لوسی با SSU یا ژن گلیکو پرتئین KDa60 (gp60) به انواع مختلف طبقه بندی شد [30 و 31] .

2.2 . توسعه آنزیمی و آنالیز منحنی ذوب :
ناحیه ی ITS-2 ( bp440 450 ، شامل توالی جانبی ) PCR ای بود که با استفاده از پریمرهای AP58SF (مستقیم : 5'-ATC TCT CAA GCG AAA TAG CAG TAA-3') و APITS-2R
(معکوس: 5'-CCC ATT GAT AAA CGG ATT TCC-3') از نمونه های DNA ژنومی فردی تقویت شد و خصوصاً به ترتیب برای 5.85 زنجیره های ITS-2 rDNA ی محدوده ای از انواع کریپتوسپوردیا ( اعداد افزایشی AF093012 , AF093008 , AF015774 , AF015773 ) طراحی شده اند [52 و 53] .
با این طراحی ، همان طور که با مقایسه بین آنالیز سیلیکو در مقابل همه ی اطلاعات متوالی در دسترس در پایگاه داده جاری نشان داده شده ، هر یک از پریمرها برای نوع کریپتوسپوردیا معین بود ( به وسیله Gen Bank) . PCR در حجم lµ25 شامل pmol 25 از هر پریمر ، mµ200 از 3.0mM , dNTP از mgcl2 ، lu پلیمر Gotaq ، (با بارگذاری رنگدار) (peomega) و mµ8 از رنگینه اضافه شده (Invitrogen) SYTO9 ، با شرایط سیکل گرمایی زیر انجام شد : c°94 ، 5 دقیقه (تقلیب اولیه) ، با 40 سیکل c°94 و 30 ثانیه ادامه پیدا می کند (تقلیب) ، c°53/30 ثانیه (بازپخت) و c°68/s30 (انبساط) ، با انبساط نهایی در c°68 برای 10 دقیقه در یک چرخاننده گرمایی ادامه می یابد ( . . . ، Rotor-Gen ، پیکربندی HO65 ، Corbett Rescarch Pty Ltd ) .
و SYTO چون مانع PCR نمی شود و به علت پایداری افزوده اش و عملکرد آن در مقایسه با سایر رنگینه ها ، به عنوان رنگینه استفاده شد [54 و 55] . اندازه گیری های نوری در کانال بسته ( با استفاده از فیلتر دیجیتال ، با تحریک در nm479 و آشکارسازی در nm510 ) در انتهای هر مرحله انبساط ثبت شدند . تقریباً ng5-10 از DNA نوری به هر PCR اضافه شدند ؛ نمونه هایی بدون قالب DNA ای به عنوان کنترل های منفی در هر اجرای PCR وجود داشتند . کم ترین مقدار قالب های ژنومی که 2 ITS - می تواند از آن ها تقویت شود و سپس روی ژل agarose نمایان شود حدود pg 1 تا 2 تخمین زده شود (مثلا ً حدودا ً هم ارز 4 انگل )(نشان داده نشده است) . برای آزمایش کردن ویژگی cPCp 19 نمونه ی DNA ی کنترلی نیاز است که شامل DNA از مدفوع یا خون انسانی که سابقه عفونت انگلی نداشته باشد و DNA از باکتری Lactobacillus acidophilvs , Escherichiacoli و L. gasseri ، مخمر saaharomyces cerevisiae ، انگل های تک یا خته ای Giardia duodenalis و Entamoeba histolytica ؛ و کرم های انگلی S.mansoni ، Schistosoma japonicum ، Hymenolepis nana ، Taenia saginata ، T. solivan (کرم های پهن ) ، Ascaris sp ، Ancylostoma duodenale ، Necator americanus ، Strogyloides stercoralis ، oesophagostomum bifurcum ، Trichuris trichiura ( Nematoda) می شود که با این روش تقویت در ارتباطند . در ادامه ی PCR ، آنالیز منحنی ذوب امپلیکن ها که به وسیله افزایش دما از ℃65 به ℃80 با شیب متغیر افزایشی که از 0.2 شروع می شود در چرخاننده گرمایی هدایت می شوند (Rotor – Gene 6000) با تغییرات دما تغییرات در فلورانس ضبط شده و رسم می شود . آنالیز HRM با استفاده از نرم افزار 1.7.27 Rotor- Gene با متعادل سازی ناحیه های بین ℃15/65 - 65/65 و ℃50/79 – 00/80 و متوسط آستانه اطمینان حدود %90 انجام شد .

2.3 الکتروفورز ژل agarose ، پلی مرفی ترکیب یک طرفه (SSCP) و توالی DNA
شدت و کیفیت امپلیکن ها با استفاده از mM 65 از Tris-HCL T ، mM 27 از اسید برمیک ، mM 1 از اسید تترااستیک دیامین اتیلن (EDTA) ، (TBE) PH9 به عنوان بافر و یک استوانه bp100 به عنوان اندازه ساز ، روی برمید اتیدم %1.5 (w/v) که باژل های agarose بی رنگ شده ، آزمایش و بررسی شوند .
آنالیز SSCP غیر ایزوتوپی براساس روش B انجام شد (56) . امپلیکن های ITS-2 انتخاب شوند از روی ستون های کوچک پاک شده (wizard PCR prep) و در lμ 30 از شسته می شوند و سپس به ترتیب دهی خودکار مرتبط می شوند (BigDge chemistry , Applied Biosystems) و در هر دو مسیر ، از همان پریمرهایی که برای PCR استفاده شد (به طور جداگانه) استفاده می شود . علامت های توالی نوکلئوتیدی وقتی با جستجوهای تشابه پایگاه داده غیر زائد GenBank در ارتباط بود بدست آمد .
(NCBI Basic BLASTN ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BIAST )

3- نتایج . 3.10 : ویژگی پریمزها و شرایطPCR و امپلیکن ها
ویژگی مجموعه ایستر AP58SF – APITS – 2R و شرایط PCR برای توسعه محدوده ی ITS-2 با به کارگیری نمونه های مختلف DNA از خون یا مدفوع انسان (بدون اثری از عفونت انگلی) و نمونه های از محدوده ی ارگانیسم های پروکاریوتیک (باکتری) یا ایوکاریوتیک (مخمر ، تک یا فتگان ، trematodes ، cestodes و کرم های انگلی) و مراحل پیشرفته ای که در مجراهای روده ای یا مدفوع انسان اتفاق می افتد ، بنا شده است . کمترین مقدار DNA ژنومی c-parvum که با استفاده از مجموعه پریمز و به وسیله PCR قابل تقویت است ، در 1تا 2 صفحه تخمین زده شده بود که با تحقیق قبلی که با استفاده از منطقه ی کوتاهتری از ITS( به طور مشخص PITS-2 ؛ با میانجی گری ] 33[ . انجام شد سازگار بود . سپس ، ویژگی امپلیکن هایی که از نمونه های DNA ی ژنومی سوا شده ، استخراج شده اند و نمایانگر انگل های مجزا شده از c.hominis (3n=) و c-parvum (3n=) هستند ، بررسی شد . در ژل های agarose نوار دوتایی (حدود 440 و bp 450) و نوار تکی (حدود bp450) مرتبا ً و به ترتیب c.hominis و c-parvum را نشان دادند . برچسب های زنجیره (> bp 200) با استفاده از پریمزهای AP58SF یا APITS – 2R از بین همه ی امپلیکن های ITS-2 (مستقیما ً) معین شدند و مقایسه زنجیره اطلاعات با آن ها در پایگاه داده جاری (AJ539190، Aj 539200، AJ539216، AJ539217، AFO93011، AFO93012) هویت مشخص هر امپلیکن را تایید کرد .

3.2 . تشخیص تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی
با اثبات ویژگی ها، امپلیکن ها و شرایط PCR ، گام بعدی شناسای شخصیت ذوب امپلیکن های ITS-2 از c.hominis یا c-parvum بود . امپلیکن هایی که نشان دهنده نمونه های DNA ی کنترلی مرجع c.hominis (3 n= ؛ کدهای ch1 ، ch2 ، ch3 ) و c-parvum (3n= ؛ کدهای cp1 ، cp2 ، cp3 ) بودند ، در ابتدا برای برقراری سازگاری (تکرارپذیری) منحنی های ذوب برای نمونه ها در طول یک اجرا و در طول کل اجراها به کار گرفته شدند . (در پنج روز مختلف انجام شد .) ارزیابی دقیق تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی (کوواریانس) با محاسبه ی میانگین و کوواریانس دمای ذوب در طول 10 تکرار از هر یک از سه نمونه در یک اجرا و در طول پنج اجرا ، انجام شد . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضریب های سنجش داخلی تغییر (واریانس) برای اولین نقطه ای اوج ذوب 0.04 (ch1) ، 0.08 (ch2) ، 0.05(ch3) و برای دومین نقطه ذوب 0.06 (ch1) ، 0.10 (ch2) ، 0.09 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum ) ، ضرایب سنجش داخلی تغییر (واریانس) ، 0.11 (cp1) ، 0.01 (cp2) 0.02(cp3) بودند . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.14 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.15 (ch3) برای اولین نقطه ذوب و برای دومین نقطه اوج ذوب ،0.25 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.12 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.32 (cp1) ، 0.22 (cp2) 0.19(cp3) بودند .
شکل 1. منحنی های معرف در آنالیز منحنی ذوب امپلیکن های ITS-2 برای c.hominis (قرمز)،
c-parvum (آبی) یا c.meleagridis (سیاه) (بالایی) ، و منحنی های هنجار شده (نرمال شده) از همان اطلاعات (در پایین) .
جدول 1 . نتایج بدست آمده از DNA ژنومی از کریپتوسپوریدیای مجزا شده از انسان های مبتلا به کریپتوسپوریدیا به وسیله آنالیز منحنی ذوب جفت شده با PCR امپلیکن ITS-2 ، و تعدادی نمونه با منحنی خاص .
بنابراین ، ارزیابی های گسترده تغییرپذیری های سنجش داخلی ومیانی را به ترتیب <%1.5 و %3.5 نشان داد . 3.3 دسته بندی نمونه ها بر مبنای آنالیز منحنی ذوب : در ادامه ، همه ی نمونه های آزمایشی DNA ی کریپتوسپوریدیا مربوط به آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR بودند ( شکل 1 . cf) . دسته بندی خاص نمونه ها (جدول 1) با نتایجی که قبلا ً به وسیله ترتیب دهی جفت شده با SSCP ی SSU بدست آمده ، مطابقت داشت .] 30،31[ . در این تحقیق ، منحنی های ذوب به وسیله ی نقطه ی اوج های ℃0.33± 72.47 و ℃0.45 ± 74.19 (منحنی 1) ، ℃0.32 ± 72.17 (منحنی 2) و ℃0.03 ± 73.33 (منحنی 3) مشخص شدند (جدول 1) . امپلیکن هایی که از نمونه های منتخب برای نمایش منحنی 1 (کدهای 10 ch ، 48 ch ، 69 ch ، 93 ch ، 94 ch ) ، منحنی 2 ( کدهای (1cp ، 23cp ، 24cp ، 75cp ، 100cp ) ، و منحنی 3 ( کد 89 cm ) بودند ، به صورت تکه ای زنجیره ای ، و بر مبنای مقایسه با زنجیره های منتخب از پایگاه داده جاری (اعداد در دسترس AFO93012 ، AJ539190، AJ 539200، AJ539217، AJ539216 ، AFO93011، AFO381167) بودند ؛] 33،53،57[ ، به ترتیب برای نمایش c.hominis ، c-parvum و c.meleagridisنشان داده شده اند . وجود دو نقطه ی اوج در منحنی 2 ، به دلیل وجود دو گونه زنجیره اندازه ITS-2 (اختلاف در حدود bp 10) در امپلیکن ها خارج شده از c.hominis بود ؛ وجود دو نوع غالب توالی سازگار با یافته های مطالعه الکتروفورزی قبلی بود . ] 33[
برای هر یک از سه نوع کریپتوسپوریدیا ، منحنی فلورانس نرمال شده از آنالیز HRM (شکل 1 ، پایینی) ، که در آن کاهش تندی در فلوئورنس ثبت شد ، با منحنی ذوب مربوط به آن سازگار بود (شکل 1 ، بالایی) .

4. مباحث و نکات پایانی :
1 اندازه ی امپلیکن های ITS-2 (bp 450 -440) استفاده شده در آنالیزهای کنونی بزرگتر از آن هایی بودند که معمولا ً برای آنالیز منحنی ذوب استفاده می شدند ، بنابراین کاهش احتمالی ظرفیت آشکارسازی جهش وجود داشت ولی با این حال ، هویت مشخص و تفکیک نمونه ها به دست آمد . در واقع ، مطالعات مختلف نشان داده است ] 54-5-58-60[ که منحنی های ذوب دارای چند نقطه اوج ( مثل c.hominis ) می تواند تجدید پذیر باشد ]54[ و نمایش نقاط اوج مختلف مشخصا ً ، برای تهیه یک منحنی واحد با تعداد افزایشی کاراکترها برای تفکیک انواع و یا ژنوتیپ ها ، مفید است . برای مثال ، رابینسون و ... ]59[ آنالیز منحنی ذوب رابرای فرق گذاشتن بین هفت نوع Naegleria ( protista) ، و تفکیک از ارتباط با willaertia magna ، با استفاده از امپلیکن های منفرد ( حدود bp 400-330) که نشان دهنده ی ITS-1 ، S 5.8 ITS-2 , ی DNA ی هسته ای است ، استفاده کردند . به طور مشابه ، راسموسن (Rasmussen) و ... ] 60[ این روش را برای تفکیک c-parvumاز c.muris با استفاده از یک سازنده (حدود bp 300) در داخل SSU ی DNA ی هسته ای استفاده کردند . این مولف ها ، همچنین ، برنامه های کامپیوتری POLAND (http://www.biophys.uni – duessel dorf .de / local / POLAND / Poland . html ) و MELTSIM (http:// ftp. Bioinformatics.org/pub/meltsim ) را ارزیابی کردند و آن ها را برای پیش بینی کردن منحنی های ذوب که بر اساس اطلاعات زنجیره ای DNA می باشند ، مفید دانستند . در پیش بینی silico ، وقتی که برای محدوده ی ITS-2 از انواع کریپتوسپوریدیا به کار گرفته می شوند ، ممکن است محدودیتی وجود داشته باشد ، چون منحنی واقعی ذوب یک امپلیکن ITS-2 (از یک نوع یا انواع ) ، مخلوطی از محدوده های ذوب متعدد برای انواع مختلف زنجیره در یک امپلیکن را نشان می دهد ( ] 33[ را ببینید) . در آزمایشگاه ، یک منحنی مرکب ممکن است در ارتباط با تغییرات دقیقی با شد چون بعضی گرایشات در تقویت انواع زنجیره های انتخاب شده در PCR تحت شرایط خاصی است . به هر حال ، تهیه مکان هندسی در انواع منحصر به فرد ( و فراوانی انگل ها) به قدر کفایت همگن است .
در میان گونه ها در توالی مختلف است ، انتظار می رود روش مجازی ]60[ برای منحنی های ذوب پیش بینی شده برای گونه ها ی منحصر به فرد کریپتوسپوریدیا مفید باشد و حتی ممکن است در پیش بینی آنهایی که به عفونت های انواع درهم آمیخته وابسته اند ، کمک کند .
تعدادی از تحقیقات قبلی عفونت های درهم شده ی c.hominis ، c-parvum در انسان هایی که از روش های فنتیک (phonetic) استفاده کرده اند ، را گزارش کرده اند ( برای مثال : PCR بر مبنای پولیمورفیسم طولی تکه ای اعضاری یا PCR های خاص ] 61-67[ ) ولی در همه ی موارد ، وجود هر نوع در امپلیکن ها به وسیله زنجیره DNA مستقیم ثابت نشد . در تحقیق کنونی ، آنالیز منحنی ذوب وصل شده به PCR نمونه ها ( شکل 2) (بر مبنای آنالیز SSCP قبلی ) شامل بودن DNA ی c.hominis ، c-parvum و c.hominis + c-parvum را اثبات کرد و معلوم کرد که این روش ظرفیت آشکارسازی عفونت های مخلوط شده را دارد . به هر حال ، بر اساس یافته های منتشر نشده ، انتظار نمی رود که آنالیز منحنی ذوب حساسیت و دقتی را که SSCP برای آشکار سازی بصری هر دوی c.hominis ، c-parvum در نمونه ها دارد ، بدست بیاورد ( ]33 و 56[ را ببینید ) . این محدودیت پنهان ، ممکن است با اتصال کاربرد PCR پشت سر هم مرکب ]68[ یا PCR کاوشگر ]69[ به آنالیز HRM از بین برود . در پایان ، روش آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR کنونی برای نمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگل کریپتوسپوریدیا مناسب است . این روش ، اگرچه کیفی است ، علاوه بر روش های الکتروفورزی ]32-34[ مزیت های دیگری خصوصا ً در ارتباط با زمان آنالیز ، عملکرد نمونه ها و ذخیره اطلاعات و ظرفیت های آنالیز دارد . نیازی به ریختن ، جابه جایی و یا بررسی ژل های الکتروفورزی نیست ، بنابراین کاهش قابل توجهی در زمان و نوینه می باشد . همچنین ، منحنی ذوب به طور اتوماتیک ضبط شده و به صورت الکتونیکی ذخیره می شوند (به صورت صفحه های گسترده) و می توانند در هر زمان برای آنالیز های مقایسه ای بازیابی شوند . اگرچه روش کندی بر مبنای استفاده از یک نشان گر ژنتیکی است ، نشان گرهای دیگر (از 100 تا bp 450) تغییر زنجیره ها را نشان می دهند . که بین گونه ها بزرگتر از داخل گونه ها است و باید قابل استفاده برای گونه های مختلف کریپتوسپوردیا باشد . بنابراین ، آنالیز منحنی کنونی ، با به کارگیری نشان گر DNA ی کنونی ، باید ابزارهای کاربردی برای تشخیص ، بررسی شیوع عفونت های کریپتوسپوریدیا از مناطق جغرافیایی خاص و برای نمایش بروز کریپتوسپوریدیا تهیه کنند . اگرچه این روش برای تشخیص عفونت با c.hominis ، c-parvum یا c.meleagridis استفاده شد ، طراحی پریمرهایی که در خاصیت و وسعت به خوبی تغییر زنجیره در ITS-2 ]35[ باشند ، این گونه ها و گونه های دیگر کریپتوسپوریدیا را که از محدوده ی شکمی شامل آب ، غذا ، خاک و مدفوع مجزا باشند ، نشان می دهد ؛ این موضوع تحقیقات بیشتری را نیاز دارد . روش های مشابه آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR باید قابل اجرا برای محدوده ای از عامل های بیماری زای پروکاریوتیک و اِیوکاریوتیک کلیدی باشند ، در صورتیکه نشان گرهای DNA ی مناسب به کار برد .
شکل 2 : یک نمونه از آنالیز منحنی ذوب فرآورده های PCR منحصر به فرد که از DNA ی ژنومی (حدود 5 تا ng 10) هر یک از c.hominis (قرمز) ، c-parvum (آبی یا c-parvum + c.hominis (سبز) تولید شده است و از یک نمونه که از ترکیب (با نسبتهای مساوی) دو فرآوده که نشان دهنده c.hominis ، c-parvum (صورتی) است بدست می آید . امپلیکن ها مربوط به آنالیز پولی مورفیسم شکل بندی تک کرانه ای SSCP بودند که از قبل آنالیز منحنی ذوب بود ]33 و 37[ تا وجود نوارهایی که نشان دهنده ی هر دوی c.hominis ، c-parvum بود را در نمونه های گونه های مخلوط شده تخمین کند . (سبز و صورتی) .

قدردانی
تشکرهای صادقانه از Annkoehlor و سازمان بهداشت ، به دولت استرالیای جنوبی (برای تهیه بعضی نمونه هاکه در این جا استفاده شد .) و از امید نور محمدی برای دسترسی به چرخاننده گرمایی ، از Garry Anlerson برای تشریح مطالب و از Corbett life برای حمایت هایش . از سرمایه گذاری Melbourne Water Comporation ، the Australian Research Council (ARC) و American Fulbright commission - the Australian قدردانی می شود .

فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد

تعداد صفحات این مقاله  12  صفحه

پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید

دانلود مقاله اثر فشار بالا روی Listeria spp در مورد خصوصیات ریز ساختاری و بافت ماهی دودی

اختصاصی از فایلکو دانلود مقاله اثر فشار بالا روی Listeria spp در مورد خصوصیات ریز ساختاری و بافت ماهی دودی دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

چکیده:
تحقیق بر روی اثر پردازش فشار بالا ( HPP) بصورت کوتاه مدت بر روی غیر فعالسازی Listeria
innocua بخوبی اثر روی بافت و ریز ساختارها صورت پذیرفت. اکسیداسیون چربی، رنگ و فلور باکتریایی بخوبی مطالعه شده است. HPP در فشار 900-700 برای 10 ثانیه غیر فعالسازی Listeria innocua را در ماهی دودی از 4500 cfu/g تا سطح غیر قابل تشخیص افزایش داد.
Listeria innocua حساس تر بود به HPP نسبت به فلور مورد آزمون قرار گرفته. کیفیت تولید از لحاظ میکروبیولوژی ارایه گردید و هیچ علامتی مبنی بر اکسیداسیون چربی وجود نداشت. اثر HPP بر روی قرمزی محصولات مشاهده نشد، گر چه فورا بر روی روشنایی اثر کرد و ماهی دودی روشن تر گردید. بسته به فعالیت و نقش زمان و فشار اثرات روی ریز ساختارها با فشار و زمان و معنی دار شدن در فشار 900 مگا پاسکال و زمان 60 ثانیه افزایش یافت. اثر روی ریز ساختار ها با کاهش باکتری منطبق بود. هدف از این مطالعه گردآوری اطلاعاتی برای صنعت روی توسعه HPP در فشار 900-400 مگا پاسکال با زمان فشار کمتر از 60 ثانیه می باشد.

مقدمه:
در سالهای اخیر تولید جهانی آبزیان افزایش یافته است و اکنون با سرعت بیشتر از بخش تولیدات غذایی حیوانی در حال رشد می باشد. عمده ای از مزارع آتلانتیک به تولید ماهی دودی و عرضه آن به بازار جهانی مشغول می باشند. اما دود ی کردن یکی از قدیمی ترین روش های پردازش است که برای توسعه غذایی مورد استفاده قرار گرفته است. زمانی که تولیدات جهانی افزایش یافت مشکلاتی از قبیل آلودگی های باکتریایی در ماهی دودی نیز افزایش یافت (Gombas, Chen, Clavero, & Scott, 2003; Gram, 2001; Gudmundsdottir
et al., 2005).
حقیقت این است که دما در خلال دودی کردن هرگز از 28 درجه افزایش نمی یابد این هیچگونه اثر معنی داری روی Listeria monocytogenes همچون ترکیب نمک و دمای پایین، سایر محافظ ها نداشته و بوسیله استفاده از کشت های میکروبی حفاظتی که می تواند جلوگیری کند از رشد در دماهای سرد صورت می پذیرد ( Fonnesbeh Vogel, Yin, Hyldig, Mohr & Gram 2006, Huss, Jorgensen & Fonnesbed Vogel, 2000; Gram 2001, Trone, teixeira& Gibbs,2006; Yoon, Burnette, Abou-Zied & Whiting 2004).
این روشها نمی توانست از رشد این باکتری جلوگیری کند. اگر ارگانیسم نتواند حذف یا کند شود و با توجه به اینکه مراحل توقف رشد معرفی و شناسایی نشده است. لذا خطرات احتمالی لازم است توسط محدودیت تاریخ مصرف در دمای 4 درجه سانتی گراد برای اطمینان از اینکه بیشتر از 100 سلول وجود نداشته باشد کنترل گردد. ممکن است جهت ترفیع محدودیت زمانی در خصوص انبار کردن نیاز به استقرار و ثبات پردازشگرهایی باشد. زیرا آن نسبت به سطح اولیه ارگانیسم در تولید تولیدات تازه واکنش نشان می دهد. و این مطلب در جهت مواجه شدن با درخواست های مشتری درباره سلامت غذا با تاریخ مصرف قدیمی می باشد. لازم است تا یک روش پردازش جدید برای ماهی دودی نیز توسعه یابد. در دهه اخیر محققان امکانات استفاده و کاربرد تعدادی از تکنولوژی های جدید در برابر این پاتوژن کشف کرده بودند.
پردازش فشار بالا یکی از این تکنولوژی های نوید بخش می باشد. این یک تکنیک نگهداری بدون دمایی ( گرمایی) می باشد که وابسته به فشار، زمان، دما و خصوصیات تولید است و آن به میکروارگانیسم ها اجازه می دهد تا با تغییرات دمایی در بافت، رنگ و طعم بعنوان مقایسه با تکنولوژی های متفاوت مرسوم غیر فعال شوند ( Carpi, Gola, Maggi, rovere & Buzzoni, 1995; Cheftel 1995;Knorr, 1993; Torres & Velazquez 2005).
اولین بار پردازش فشار بالا در مورد غذاها توسط Hite که در سال 1899 که استفاده کرد این تکنولوژی را برای افزایش تاریخ مصرف شیر گزارش شد و سپس چندین مطالعه روی غذاهای متفاوت منتشر شد. اکثر مطالعات به کاربرد HPP بر روی غذاهای دریایی که روی اثرات آن روی پروتئین ها از جمله ( Angsupanich, Edde & Ledward, 1999) رنگ ماهیچه (Amanatida et al,2000, Ohshima, Ushio &Koizumi, 1993) چربی ها ( Chevalier, Bail & Ghoul,2001;Ohshima, Nakagwa & Koizumi 1992) و باکتری ها ( Amanatidou et al 2000, Smelt 1998) اجرا شده است ، مربوط می باشد.
اثر HPP روی L.monocytogenes در خصوص اثر تیمار زمان (Patterson, Quinn, Simpson & Gilmour, 1995; Simpson & Gilmour 1997)، فشار (Shigehisa, Ohmori, Saito, Taji & Hayashi 1991) و حداقل شرایط 3 پارامتر ( فشار- زمان – دما) برای افزایش کاهش حیات سلول ( Ritz et al) بسیار مطالعه شده است.
Lakshmanan و Dalgaard در سال 2004 نشان دادند که فشار در 250 مگا پاسکال غیر فعال نکرد. L.monocytogenes اما فازهای تاخیری در روزهای 17 و 10 و در دمای 5 و 10 درجه به ترتیب مشاهده شدند. فشار در 200 مگا پاسکال اثراتی روی دما و بافت ماهی دودی سرد داشت.
مطالعه دیگر نشان داد که تیمار فشار بالا بر روی ماهی دودی منجر به توسعه تاریخ مصرف از 60 به 180 روز در 3 یا 8 درجه بدون تغییرات حسی، میکروبیولوژی، شیمیایی گردید و حضور پاتوژن را در نمونه های تلقیح شده بصورت معنی داری و بصورت کامل غیر فعال کرده بود ( Garpi et al, 1995).
Montero, Gomes –Estaca و Gonez-Guillen در سال 2007 ارایه کردند که ماهی دلفینی دودی سرد تحت شرایط شوری زیاد و دودی شدن ( 93/2 % نمک و فنل 82ppm) پردازش شد و در ترکیب با تنظیم فشار در 300 مگا پاسکال در دمای 20 درجه به مدت 15 دقیقه تعدادی از L.monocytogenes به مدت صد روز در انبار نگهداری شدند. مقاومت میکروارگانیسم ها به فشارهای مختلف وابسته به فشار، زمان و دما می باشد.
با افزایش تیمار فشار و زمان برخی از L.monocytogenes در فرآورده های پنیری، گوشتی و آب میوه کاهش یافت (Fonberg – Broczek et al 2005).
L.monocytogenes مشخص گردید که به تغییرات فشار بسیار حساس هستند و منجر به هزینه های HPP می شود که آن باید با افزایش تیمار فشار و نگهداشتن تیمار زمان مرغوب شود ( Chen, Guan & Hoover 2006). اکثر مطالعات مربوط است به کاربرد HPP غذاهای دریایی که بکار بردند فشار 700-200 مگا پاسکال را برای 3، 5،10،15 یا 20 دقیقه (Torres & Velazquez 2005).
اگرچه توسعه های جدید در تکنولوژی فشار بالا این امکان را فراهم نموده است که فشار بالا را تا 10 ثانیه تحمل نمایند. هدف این تحقیق برای مطالعه اثر HPP ( 400-900 مگا پاسکال) روی بقایای Listeria innocua و خصوصیات ( ریز ساختاری، بافت و رنگ) ماهی دودی سرد در خلال 10-20-30 و 60 ثانیه می باشد. تغییرات در تعداد کلی باکتری های زنده، باکتری های اسید لاکتیک و اسپورهای باسیلوس تحقیق گردیده است.

2- مواد و روش:
آماده سازی محیط باکتری:
به منظور انتخاب نوع استرین دراین تحقیق یکسری مطالعه قبلی بر روی 6 استرین L.monocytogenes و 2 استرین L.innocua صورت گرفته است.
تمامی استرین ها از ifl بعد از جداسازی از تولید یا پردازش محیط در خلال دودی کردن بدست آمده اند. استرین ها کشت شدند بصورت شبانه در Tryptic Soy Broth با 6/0 گرم عصاره مخمر در 35 درجه و دوباره زیر کشت شدند. تمامی این استرین ها با یک تکنیک ژنتیکی الکتروفورزی مقایسه گردیدند( Gudmundsdottir et al, 2005).
استرین ها برای تاثیر HPP روی کاهش تعداد باکتری تست شدند:
L.innocua, strain Eu2173/E-34, Eu 2172/E-33; L.monocytogenes, strain E1, E5, H-01-170, L-327,L-435, L-462).

2-2: ماهی دودی سرد
ماهی قزل آلای آتلانتیک ( Salmo salar) پرورش داده شد و ذبح شد در Rifosht شمال ایسلند.
بعنوان یک نمونه، 50 ماهی 4-3 کیلوگرمی که بصورت تصادفی از یک جمعیت بزرگ انتخاب شده بودن در ابتدا ذبح و سپس بر روی یخ نگهداری شدند. دو روز بعد ماهی در اتاق دود در ناحیه Reykjavik دودی شد. لایه های ماهی در آب شور، شامل 8 گرم Na Cl در 100 سی سی آب برای 24 ساعت نمک زده شدند و در طول 24 ساعت در دمای 20-18 درجه سانتی گراد دودی شدند. هر لایه ماهی خالی شد و فورا برای آزمایشگاه ماه های ایسلند ( IFL) ارسال گردید. روز بعد لایه ها بریده شدند به قطعات 50-30 گرمی (6*4 سانتی متر) و بسته بندی شدند با Magic Vac TM Champion.
قبل از بسته بندی نصف نمونه ها با یک سی سی از سوسپانسیون باکتری (2*105 cfu/ml) از باکتری ( L.innocua,E-34) برای بدست آوردن یک غلظت نهایی 103-104 cfu/g در نمونه ماهی آلوده شدند و در بافر مخصوص رقیق سازی انجام شد.
نصف دیگر آلوده نشدند اما با فشار بالا پردازش شد و برای آنالیز بافت و ریز ساختار استفاده شد. روز بعد نمونه ها به دانشگاه برلین، بخش مهندسی پرداذش غذا و بیوتکنولوژی غذا منتقل شدند.
روز ششم و هفتم نمونه های ماهی ها با فشار بالا در 400، 500، 600، 700، 800 و 900 برای 10، 20، 30 و 60 ثانیه پردازش شدند. روز هشتم نمونه ها به ایسلند برای میکروبیولوژی در IFL و محتویات نمک و تیو باربیوتیک اسید جهت آزمایش، و تعیین خصوصیات مواد استفاده شده برای این تحقیق ارسال گردید. نمونه ها برای این آنالیز ها از مواد خام و در مراحل مختلف پردازش بدست آمدند.

2-3: حجم آب، چربی و نمک، اکسیداسیون چربی، فعالیت آب و آنالیز pH:
حجم آب مطابق با ISO 6496 (1999). اندازه گیری شد. سپس نمونه ها در یک اون در دمای 103+_2 برای 4 ساعت حرارت داده شدند. حجم آب مطابق با کاهش وزن بود. اسید چرب آن با روش عصاره گیری با استفاده از یک ماشین عصاره گیری سیستم اتوماتیکی 2050 Soxtec Avanti( Aocs, 1998 با نفت خام، در دمای 60-40 درجه سانتی گراد جوشانده شد.
حجم نمک مطابق با AoAc(2000) اندازه گیری شد ، محلول کلرید از نمونه ها با آب شامل اسید نیتریک عصاره گیری شد. حجم کلرید محلول با نیترات نقره تیتر شد و به منظور تعیین پتانسیل آن رقیق گردید.
اکسیداسون لیپید: واکنش تیوباربیتیک اسید با یک مدل اصلاح شده تعیین شد (Soensen, Jorgensen 1996). روش عصاره گیری توسط( Vyncke 1970,1975)البته با مقداری تغییرات شرح داده شده است.
اندازه نمونه ها کاهش یافت تا 15 گرم و با 300 سی سی از 5/7 گرم در 100 گرم تری کلرواستیک اسید شامل 1/0 گرم در 100 گرم از EDTA و Propyl gullate هموژنیزه شد. جذب نمونه ها و استاندارد ها در 530 نانومتر اندازه گیری شد ،میزان malondialdehyde در هر کیلوگرم از نمونه ها با استفاده از malondiadehy-bis(diethyl acetate) بعنوان استاندارد محاسبه شد.
فعالیت آب با استفاده از کپسول Aw-Wert-Messer در 22 درجه سانتی گراد اندازه گیری شد و در انکوباتور برای حداقل 4 ساعت نگهداری شد. کالیبراسیون و اصلاح دما بر اساس دستورالعمل تولید تنظیم گردید.
آنالیز pH: تقریبا 5 گرم از بافت له شده با همان میزان از آب مخلوط شد و اندازه گیری pH با استفاده از PHM 80 portable Radiometer Analyted Copenhagen با یک الکترود غوطه ور مطابق با دستور العمل تولید بعمل آمد. تمامی آنالیزها بصورت دوتایی و سه تایی انجام شد.

2-4: آنالیز میکروبی: برای آنالیز میکروبی 25 گرم از نمونه های ماهی به 225 سی سی Maximum Recovery Diluent اضافه شد و در (Stomacher 400,A. J. seward, London. UK)stomacher برای دو دقیقه مخلوط شد. رقت های 10 تایی آماده شد بوسیله اضافه کردن یک میلی لیتر رقت های قبلی به 9 میلی لیتر MRD، Total Viable Psychrotrophic Count (TVC) و روی آگار مطابق با Van Spreekens (1974) با 1 گرم Na Cl/100gr ( 15 درجه سانتی گراد برای 7-5 روز)پخش گردید.
اسید لاکتیک باکتری تعیین شد با پخش شدن روی آگار Nitrite Actidione Polymyxin (NAP) برای 22 درجه سانتی گراد برای 5 روز. برای تایید وجود LAB، تست کاتالیز انجام شد. اکثر روشهای استاندارد برای شمارش Listeria و محیط و مراحل مطابق با روش USDA-FSIS استفاده شد (2002).
اساس غنی سازی مایع Listeria بعنوان مرحله پیش غنی سازی مطابق با تلقیح مایع Fraser با یک زیر کشت برای یک آگار اصلاح شده Oxford از تمام تیوب های سیاه استفاده شد. در این مورد 3 تیوب با 3 بار رقیق شدن استفاده گردید. محدودیت برای این روش MPN 0.3 cfu/gr (نمونه های جامد و مایع) می باشد. یک میلی لیتر از نمونه های هموژنیزه به اولین لوله منتقل شد. هر کدام شامل 10 میلی لیتر UVM در غلظت دو برابر. رقت سوم در یک غلظت از UVM ساخته شد. اندازه نمونه ها 1, 0.1 , 0.01 از ماهی در هر 10 میلی لیتر می باشد. برای شمارش اسپور باسیلوس 10 میلی لیتر از 10/1 ترکیب در 75 درجه سانتی گراد برای 30 دقیقه حرارت داده شد. تکنیک Pour Plate روی بشقابک شمارش انجام شد. بشقابک ها در 35 درجه سانتی گراد برای 2 روز انکوبه شدند. تمامی آنالیزها با دو تکرار انجام شد.

2-5: پردازش فشار بالا ( HPP).
2-5-1: اثر HPP روی کاهش Listeria spp :
مطالعه قبلی روی HPP در Ice Tec با استفاده از یک سیستم فشار بالای اتوکلاو مهندسی شده ( Erie, PA. USA) صورت گرفت. حداکثر فشار طراحی شده برای سیستم 500 مگا پاسکالی و در دمای اتاق بود. سایز نگهدارنده نمونه 41/2 بود. فشار عبور محیط 5 ml/100 ml روغن در محلول آبی بود. سوسپانسیون سلول 1میلی لیتر تلقیح شده به یک گاز که قرار گرفته در یک کیسه پلاستیکی و وکیوم شد توسط Magic VacTM Champion. استرین های باکتریایی در فشار بالای ( 350 مگا پاسکال برای 5 و 20 دقیقه در دمای 22 درجه سانتی گراد) تیمار شدند. مجموعا 5 دقیقه نیاز است تا به این فشار در حالیکه فشار به آرامی کم می شود در 30 ثانیه برسد.

2-5-2: پردازش فشار بالای ماهی دودی:
پردازش فشار بالای ماهی دودی در دانشگاه فنی برلین بخش مهندسی پردازش غذا و بیوتکنولوژی در آلمان در یک سیستم فشار بالای طراحی آزمایشگاهی بعمل آمد. حداکثر فشار طراحی شده برای سیستم در یک رنج دمای 100- 25- 1000 Mpa بود.
سایز نگهدارنده نمونه ها 751/0 بود . مخلوط آب و گلیکول بعنوان محیط انتقال فشار استفاده گردید. اکثر استرین های مقاوم به HPP (E-34) L.innocua از نتایج مطالعه قبلی برای ادامه مطالعه اصلی انتخاب شدند. نمونه های ماهی بسته بندی شده دارای عاج و بدون عاج پردازش شدند در فشار بالا در 400، 500، 600، 700، 800 و 900 مگا پاسکال برای 10، 20، 30 و60 ثانیه. دما در خلال زمان نگهداری ( پس از حرارت دهی) به 42 درجه سانتی گراد در تمامی آزمایشات رسید. نمونه های بدون تفاوت فشار داخلی و خارجی بعنوان کنترل استفاده شدند. 10 ثانیه مورد نیاز است برای رسیدگی به 400، 500 و 600 مگا پاسکال و 20 تا 25 ثانیه برای رسیدن به 700، 800 و 900 مگا پاسکال.

2-6: آزمایشات ذخیره سازی با نمونه های عاجدار ماهی دودی سرد: آزمایشات ذخیره سازی نمونه ها بعد از دو تیمار HPP ( 500 و 900 مگا پاسکال) و نمونه های حرارت ندیده بعنوان کنترل دمای ذخیره سازی 5/5 درجه سانتی گراد استفاده شد. نمونه ها برای تغییرات میکروبی ( LAB و TVC و اسپورهای باسیلوس)، بقای L.innocua و برای اکسیداسیون لیپید در روزهای 5 ، 12 ، 26 و41 تست شدند.

2-7: ریز ساختارها:
نمونه ها برای آنالیز ریز ساختاری از قطعات ماهی تیمار شده HPP انتخاب شدند و با استفاده از یک چاقوی چوب پنبه ای، به قطر 11 میلی متر بریده شدند. آنها در لوله های پلاستیکی 15 میلی متری از نظر قطر و 30 میلی متر درازا قرار گرفتند( Kartella, Novigilo, Italy) و در نیتروژن مایع منجمد شدند. منجمد کردن در دمای زیر 80- درجه سانتی گراد تقریبا به مدت 40 ثانیه انجام شد. نمونه های منجمد شده در 80- درجه سانتی گراد ذخیره شدند تا رنگ آمیزی شوند. نمونه ها برش خورده در 27- درجه سانتی گراد در یک (Leica, Heidelberg, Germany) Leica CM1800 cryostat با برش های 10µm ضخامت منجمد شدند. قطعات بر ش خورده روی اسلاید های شیشه ای قرار گرفتند و با G نارنجی (0.5 g CI 16230 (polysciences, Warrington, PA)) و 99 میلی لیتر آب مقطر و یک میلی لیتر استیک اسید رنگ آمیزی شدند. ابتدا قطعات با آب مقطر شسته شدند و به مدت 5 دقیقه در محلول متیل بلو (0.07gr CI 42780) و 99 میلی لیتر آب و یک میلی لیتر استیک اسید رنگ آمیزی شدند. نمونه های رنگ آمیزی شده به مدت 5 دقیقه با آب مقطر شسته شدند ، سپس در دمای اتاق خشک و با MOUNTEX سوئدی شمارش شدند. نمونه ها با یک میکروسکوپ نوری ( Leica DM RA2) در بزرگنمایی 100 مورد بررسی قرار گرفتند و اشکال با استفاده از دوربین دیجیتال Leica DC300F عکسبرداری شدند.
عکس های ریز ساختاری نمونه ها در نرم افزار Leica QWin آنالیز شدند و میزان مواد غیر سلولی آنها اندازه گیری و شمارش شدند. در واقع فضای بین سلولی آنالیز شدند.

2-8: سنجش بافت:
تیغ برش Warner- Bratzler با ضخامت 3.21 mm و درازای 125 mm و پهنای 70mm برای آنالیز کردن بافت ( TA,XT2) استفاده شد.
این تیغ نمونه ها رابا یک سرعت ثابت 2 تا 5 ثانیه ای برش می زند.
نرم افزار کامپیوتری برای نقشه / طرح یک زمان فشار تنظیم گردید و نتایج بعنوان حداکثر میزان نیرویی که لازم است برای برش نمونه ها استفاده گردد، بیان شد. نواحی زیر نمودار بعنوان پارامتری دیگر محاسبه گردید و میزان کلی کار مورد نیاز برای برش نمونه ها مشخص گردید.
این روش آزمون تراکم سازی فیبرهای تحت فشار تیغ، سفتی در فیبرهای نزدیک به هم را و برش فیبرها را ( Bouton, Harris & Shorthouse, 1975).
سنجش های بافت روی نمونه های برش خورده نواری انجام شد. و هر نمونه 3 مرتبه سنجش شد.

2-9: آنالیز رنگ:
شدت نور رنگ با استفاده از Mini Scan XE plus در آزمایشگاه Hunter Lab که استفاده می کند از منبع نوری D65 اندازه گیری شد.
دستگاه ها میزان L ( روشنایی، شدت نور سفید)، a ( قرمزی- شدت رنگ قرمز) و b ( زردی و شدت رنگ زرد) هر نمونه را ثبت نمودند و این آزمون 3 مرتبه انجام شد.

2-10: آنالیز آماری:
اختلاف آنالیزی (ANOVA) بر روی آمار میکروبی و میزان TBARS در برنامه آماری (NCSS, Utah, USA) NCSS 2000 انجام شد. این برنامه چندین مقایسه با استفاده از Tukey-Karmerرا محاسبه می کند. همین آزمون برای بافت و ریز ساختار ها با استفاده از برنامه آماری Sigmastat ورژن 03/2 ( Systat Software Inc, California, USA ) استفاده شد و نتایج ملاحظه شده در 0.05 < P معنی دار بود.

نتایج:
مشخصات و خصوصیات ماهی دودی سرد:
نتایج برای الگوی خشک، نمک، چربی و TBARS حداقل 2 یا 3 برابر ارایه شد. ماهی دودی سرد شامل 37.2 g/100g +_0.4 ماده خشک و 3.2 g Na Cl /100 g+_0.1 مطابق با 4.9%+_0.2% فاز آبی، چربی شامل 9.6g/100gr+_0.4 و pH در حدود 6.1+_0.1 بود.
میزان TBARS پایین بود 3.9 µmol/kg¬0.1 µmol/kg. TVC روی LH و میزان LAB روی NAP در ماهی دودی سرد در مراحل مختلف پردازش در برشهای خام بعد از نمک زدن و شستن و بعد از مرحله دودی کردن تعیین شد ( شکل 1). تعداد باکتری از <1 log cfu/g به 2.6 log ¬ 0.2 log cfu/g و به 2.7 log+_0.1 log cfu/g به ترتیب افزایش یافت.
افزایش TVC اتفاق افتاد بعد ازمرحله نمک زنی و شستن زمانی که میزان LAB افزایش یافت در خلال پردازش و در تولید نهایی LAB از نظر میزان کلی غالب بود. این خوب است که بدانیم اکثر LAB روی LH زیاد خواهد شد و بنابراین آن شرح می دهد که LAB فلور ضایعات غالب در نمونه ها هست.
هیچکدام از اسپورهای Listeria و باسیلوس تشخیص داده نشد در هر کدام از این نمونه ها.
3-2: آزمون رقابت با L.innocua:
تعداد L.innocua در کشت شبانه بود 2.03 *109 cfu/ml.
ماهی دودی سرد عاجدار بود با رقت 104 کشت شبانه و تعداد نهایی L.innocua در نمونه های عاجدار بود 4.5 *103 cfu/g.
افزایش فشار از 400 به 900 مگا پاسگال یک اثر معنی دار روی کاهش از >110 cfu/g به 0.3 cfu/g بعد از 10 ثانیه داشت ( جدول 1).
در فشار 500-400 مگا پاسکال کاهش باکتری ها کمتر بود از 5/1 -1 سیکل لگاریتمی. با افزایش زمان فشار در 600 و 700 مگا پاسکال افزایش یافت.
این نتایج نشان می دهد که باید فشار تا بالای 900-700 مگا پاسکال باشد تا اثر کافی داشته باشد در کاهش تعداد L.innocua در ماهی بسته بندی شده دودی سرد با توجه به سلامت تولید.
تعداد اولیه میکروب های گیاهی ( باکتریوم) در تولید عاجدار شدن مورد آزمایش قرار گرفت و مشخص گردید که در حدود 4500 cfu/g میباشد که برای بازار مناسب نیست.

3-3: آزمون دخیره سازی با نمونه های عاجدار ماهی دودی سرد:
3-3-1: آنالیز میکروبی: میزان باکتری اولیه در نمونه ها شرح داده شده در قسمت 1 و 3.
هیچ Listeria spp در نمونه های کنترل ( بدون عاج و بدون فشار) حتی بعد از 41 روز ذخیره شدن در 5/5 درجه سانتی گراد تشخیص داده نشده ( شکل 2 و 3). که این نشان می دهد یک کیفیت خوب و سلامتی را در مواد خام استفاده شده در این آزمایش. شکل 2 نشان می دهد که L.innocua در خلال انبار کردن کاهش یافت. هیچ کاهشی بعد از 10 ثانیه مشاهده نشد و ان بدون تغییر تا بعد از 26 روز باقی می ماند. با افزایش تیمار زمان تا 20 و 30 ثانیه مشخص شد کاهش در خلال 12 روزهای اولیه انبارکردن اتفاق می افت اما بعد از اینکه باکتری ها بهبود یافتند و تعداد افزایش یافت. هیچ L.innocua در 5 روز بعد از تیمار HPP در فشار 900 مگا پاسکال تشخیص داده نشد ( شکل3 ). اما بعد از انبار کردن در دمای 5/5 درجه سانتی گراد روزهای 41-21 سطح کاهش یافت ( 0.3 -20 cfu/g).

نمودار 2 و 3 شرح می دهد تغییرات را در مقدار TVC و LAB در ماهی دودی سرد وکیوم شده بعد از تیمار فشار و در خلال انبار کردن در 5/5 درجه سانتی گراد.
میزان LAB بصورت قابل ملاحظه ای از TVC یا log 5.5 در مقایسه با log 3.7 در نمونه های تیمار نشده بیشتر بود که نشان می دهد با استفاده از LH در 15 درجه سانتی گراد تعدادی از LAB نمی توانند رشد کنند ( جدول 2). متاسفانه LAB شناسایی نشد از بین گونه ها. در روز 5 میزان TVC بود 0.2 -1.2 log کمتر در نمونه های تیمار شده در فشار 500 mpa در مقایسه با نمونه های تیمار نشده ( جئول 2). در خلال انبار کردن تعداد افزایش یافت و بعد از روز 41 انبار در حدود 0.8-2.7 log افزایش یافت.
تعداد LAB کاهش معنی داری داشت در مقایسه با نمونه های تیمار نشده اما در خلال انبار داری 4-6 log افزایش یافت که این نشان می دهد LAB می تواند سریعتر دوباره احیا شود بعد از تیمار شدندر فشار 500mpa زمانی که نمونه ها تیمار شدند در فشار 900Mpa یک کاهش معنی داری دارد. TVC از Log 2-3 مشاهده شد زمانی که مقایسه شد با نمونه های تیمار شده بدون فشار در روز پنجم.

فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد

تعداد صفحات این مقاله 28   صفحه

پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید

عکس با وضوح بالا از پیتزا پپرونی نمای نزدیک

اختصاصی از فایلکو عکس با وضوح بالا از پیتزا پپرونی نمای نزدیک دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

ابعاد:8000X8000 Pixel

کیفیت رزولیشن:300Dpi

فرمت:JPG