بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها
خلاصه :
کریپتوسپوریدیایی انسان ها یک بیماری روده ای است که معمولاً به علت عفونت در cryptosporidium hominis یا c-parvum به وجود می آید . این بیماری بیشتر از راه دهان – مدفوعی منتقل می شود (آب یا غذا) و اثر اجتماعی – اقتصادی عمده ای در جهان دارد .
عامل اصلی در پیشگیری ، مراقبت و کنترل کریپتوسپوریدیایی ، تشخیص و ویژگی ژنتیکی گونه های عمده و گوناگونی جمعیت ( که ژنوتیپ یا subgenotye هم خوانده می شود ) کریپتوسپوریدیای منتقل شده به انسان است به خصوص اینکه در حال حاضر هیچ شیمی درمانی موثر ضد کریپتوسپوریدیا یا واکسنی وجود ندارد . در این تحقیق ، ما با استفاده از دومین جدا کننده رونویسی داخلی (ITS-2) DNA ریبوزومی هسته ای به عنوان نشانه ژنتیکی ، روش بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) واکنش زنجیره ی پلیمری جفت شده را برای تشخیص سرایت c-parvum, Cryptosporidium hominis یا c.meleagridis بنا کردیم . یک ارزیابی از منحنی ، تغییر پذیرهای داخلی کوچکتر از %1.5 و تغییر پذیری های معیاری داخلی کوچکتر از %3.5 را معلوم کرد . c.parvum , Cryptosporidium hominis و c.meleagridis با استفاده از 143 نمونه DNA ی انگل های کریپتوسپوریدیم که از استرالیایی های مبتلا به کریپتوسپوریدیا گرفته شده به ترتیب در سال های 2,44,97 کشف شدند . منحنی های ذوبی که با حداکثر دمای c°33/0 ± 47/72 درجه و c°45/0 ± 19/74 درجه سانتی گراد ( نمودار1) ، c°32/0 ± 17/72 (نمودار 2) و c°03/0 ± 33/73 (نمودار3) مشخص می شوند به طور ژنتیکی به ترتیب به عنوان c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شناخته می شوند . در نتیجه ، بررسی ذوب PCR جفت شده ی ITS-2 باعث تشخیص c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شد . این راه مناسب ترین راه برای آزمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگلی کریپتوسپوریدیم است و اگر چه کیفی است نسبت به بررسی الکتروفورتیک به طور قابل توجهی زمان کمتری برای اجرا می گیرد و مزیت افزوده ذخیره ی اطلاعات و قابلیت آنالیز در سیلیکو را نیز دارا می باشد . این روش ابزار مناسبی برای بررسی همه گیری و شیوع کریپتوسپوریدیا را در اختیار می گذارد و قابل اجرا برای انواع دیگر کریپتوسپوریدیا به جز آن هایی که در این جا بررسی شد ، می باشد .
1. مقدمه :
کریپتوسپوریدیای انسانی معمولاً یک بیماری روده ای است که توسط انواع کریپتوسپوریدیا ایجاد می شود و به وسیله راه های دهانی – مدفوعی منتقل می شود [1] . این بیماری به طور ناگهانی اتفاق می افتد [2و3] اما عموماً به دوران کودکی – مراکز مراقبت مربوط می شود و از استخرهای شنا یا آب های نوشیدنی منابع سرایت می کند . [4-9] . بحث دوم که مهم است ، این است که انگل های اولیه Cryptosporidium در مقابل مواد ضد عفونی کننده مثل کلر که عموماً برای پاکسازی آب استفاده می شود ، مقاوم هستند [10-12] . شیوع های از راه آب که از کشورهای توسعه یافته مثل آمریکا و کانادا گزارش شده اند و قابل توجه ترین آن که در سال 1993 در Milwaukee اتفاق افتاد منجر به 5000 مورد تایید شده و بیش از 400،000 مورد مشکوک به کریپتوسپوریدیا شد [4و5و13و14] . به علت حالت جهندگی انگل ها در آب و محیط [15] ، هزینه نسبتاً بالا و دسترسی محدود به ترکیبات شیمیایی یا رژیم های درمانی یا واکسیناسیون در انسان ها و دیگر حیوانات [16-20] و اثر اجتماعی – اقتصادی آن ( مخصوصاٌ در جوامع انسانی که در آن ایدز / HIV شایع است ) . کریپتوسپوریدیا توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان یک عامل بیماری زا که کیفیت آب را نشان می دهد ، رده بندی شد [12] . تشخیص قاطع کریپتوسپوریدیا در انسان ها که شامل شناسایی و تشریح خصوصیات انواع کریپتوسپوریدیا است ، عامل اصلی در کنترل این بیماری و فهمیدن عواقب همه گیری آن است . محدودیت های قابل توجهی با بکارگیری روش های سنتی ، میکروسکوپی ، بیوشیمیایی و سرم خونی برای تشخیص قاطع وجود داشته اند به طوری که ابزارهای ژنتیکی – مولکولی پیشرفته شناسایی و توسعه یافته اند [22] . با استفاده از این ابزارها در حال حاضر ، بیش از 18 نوع کریپتوسپوریدیا و تعداد زیادی ژنوتیپ شناخته شده است [6و23و24] که c.hominis و c.parvum نوع غالب آن ها هستند و در انسان ها پر اهمیت ترین هستند ( به جز تعداد معدودی ، بقیه انواع هم اغلب به این دسته تعلق دارند ) ( مثل [26-28] ) . ابزارهایی که بر مبنای وواکنش زنجیره ی پلیمری (DCR) هستند به طور گسترده ای به کار گرفته شده اند ، چون حساسیت آنها گسترش خاصی از مکان ژنتیکی را از مقدار ناچیزی از مواد انگلی مجازی دارد [29] . مکان های مختلف که شامل واحد تبعی کوچکی [667] از فضاگیرهای RNA ریبوزومی هسته ای و DNA ی ریبوزومی (rDNA) ، پروتئین چسبناک مربوط به ترومبوسپونوین (trop) ، پروتئین شوک حرارتی (hsp70) 70KDa و ژن های پروتئین دیواره انگلی کریپتوسپوریدیا (cowp) می شود ، برای شناسایی و اختلاف بین انواع کریپتوسپوریدیا و متغییرهای ژنتیکی ( ژنوتیپ و ژنوتیپ وابسته) به کار گرفته می شوند [22] . اخیراً ، PCR جفت با روش های پویش جهشی الکتروفوز ترکیب شده با زنجیره ی DNA ، برای این هدف به کار گرفته می شوند [30-31] . برای مثال ، برای غلبه بر محدودیت هایی که در آنالیز تغییر پذیری متوالی در حین فرآورده های PCR وجود داشت پولیمر فسیم ( چند ریختی بودن ) ترکیبی تک استانداردی (sscp) ، برای نمایش مستقیم اختلاف ژنتیکی در hsp70 , SSU و دومین فضاگیر داخلی رونویسی (ITS – 2) هسته ای rDNA ی c.hominis و c.parvum معین شدند [30-36] . مزیت های این روش های الکتروفورزی (مثل خاص بودن ، حساسیت و قابلیت تکثیر کم و زیاد ) از میان نتایجی که از مقایسه مستقیم یک روش SSCP با تعدادی از روش های مختلف مولکولی که برای توصیف ویژگی های ژنتیکی یک نوع کریپتوسپوریدیای انتخاب شده بدست آمد ، اثبات شد [37] . اگرچه این روش بسیار مفید و موثر است ولی آنالیز الکتروفورزی ، در بعضی موارد ، می تواند وقت گیر باشد .
به علت نیاز افزوده به تشخیص با بازده بالا و بررسی ژنتیکی عامل بیماری و نیز جا به جایی اطلاعات ، بررسی ذخیره سازی در سیلیکو ، توجه قابل ملاحظه ای روی ارزیابی و گسترش روش های مرور جهش وجود داشته است که به مشخصه های ذوب امپلیکن ها و آنالیز الکتروفورزی گریزی وابسته است . این روش که خصوصاً برای آنالیز منحنی ذوب با تکنیک بالا (HRM) و منحنی ذوب مبتنی بر RCR به کار می رود ( مثال [38-41] ) و به طور قابل توجهی زمان مورد نیاز برای آزمایش را کاهش می دهد ، می تواند به سرعت بالای آشکارسازی جهش برای امپلیکن های کوچک ( معمولاً bp100 تا 250) برسد [42 تا 45] و منجر به نتایج کیفی و کمی شود . [38و46-49] . در این تحقیق ، روش کاربردی آنالیز منحنی ذوب PCR جفت شده ارزیابی و بنا شد ، ITC – 2 به عنوان ژنتیک ساز برای آشکارسازی نوع غالب کریپتوسپوریدیای سرایت شده به انسان به کار گرفته شد و در مورد دلایل این روش تشخیصی- مولکولی بحث شد .
2- مواد و روش ها
2.1 نمونه ها و جداسازی DNA ژنومی
نمونه های مدفوعی (143 =n) از بیماران مبتلا به کریپتوسپوریدیا از استرالیا جمع آوری شدند . تشخیص کوپرولوجیکی کریپتوسپوریدیا بر اساس آشکارسازی انگل ها با استفاده از روش لکه دار کردن اصلاح شده ذیل – نیلسن ایجاد شده [50] . DNA ژنومی همان طور که توسط مورگان و دیگران توصیف شده از نمونه های مدفوعی استخراج شد [51] . در اصل ، نمونه های مدفوعی فردی در محلول نمک بافر فسفات (PBS) معلق بودند (1:4) . سوسپانسیون ( محلول ) یکدست و یکنواخت شده و lµ20 از آن بیرون کشیده شد و به lµ80 از (pvpp) (sigma) پلی پیرولیدرن پلی دینل %10 معلق در H2O اضافه شد . بعد از اضافه شدن PVPP ، نمونه ها برای 10 دقیقه در دمای c°100 حرارت دیدند و سپس برای 30 ثانیه در kg 10،000 سانتریفیوژ شدند . بعد از سانتریفیوژ ، هر یک از ذرات شناور به یک لوله جدید منتقل شد و کل DNA با استفاده از mini-column (Qiagen,copro-kit,Germany) براساس دستورالعمل سازنده جداسازی شد . نمونه های DNA ژنومی قبلاً براساس PCR ترتیب دهی شده با SSCP لوسی با SSU یا ژن گلیکو پرتئین KDa60 (gp60) به انواع مختلف طبقه بندی شد [30 و 31] .
2.2 . توسعه آنزیمی و آنالیز منحنی ذوب :
ناحیه ی ITS-2 ( bp440 450 ، شامل توالی جانبی ) PCR ای بود که با استفاده از پریمرهای AP58SF (مستقیم : 5'-ATC TCT CAA GCG AAA TAG CAG TAA-3') و APITS-2R
(معکوس: 5'-CCC ATT GAT AAA CGG ATT TCC-3') از نمونه های DNA ژنومی فردی تقویت شد و خصوصاً به ترتیب برای 5.85 زنجیره های ITS-2 rDNA ی محدوده ای از انواع کریپتوسپوردیا ( اعداد افزایشی AF093012 , AF093008 , AF015774 , AF015773 ) طراحی شده اند [52 و 53] .
با این طراحی ، همان طور که با مقایسه بین آنالیز سیلیکو در مقابل همه ی اطلاعات متوالی در دسترس در پایگاه داده جاری نشان داده شده ، هر یک از پریمرها برای نوع کریپتوسپوردیا معین بود ( به وسیله Gen Bank) . PCR در حجم lµ25 شامل pmol 25 از هر پریمر ، mµ200 از 3.0mM , dNTP از mgcl2 ، lu پلیمر Gotaq ، (با بارگذاری رنگدار) (peomega) و mµ8 از رنگینه اضافه شده (Invitrogen) SYTO9 ، با شرایط سیکل گرمایی زیر انجام شد : c°94 ، 5 دقیقه (تقلیب اولیه) ، با 40 سیکل c°94 و 30 ثانیه ادامه پیدا می کند (تقلیب) ، c°53/30 ثانیه (بازپخت) و c°68/s30 (انبساط) ، با انبساط نهایی در c°68 برای 10 دقیقه در یک چرخاننده گرمایی ادامه می یابد ( . . . ، Rotor-Gen ، پیکربندی HO65 ، Corbett Rescarch Pty Ltd ) .
و SYTO چون مانع PCR نمی شود و به علت پایداری افزوده اش و عملکرد آن در مقایسه با سایر رنگینه ها ، به عنوان رنگینه استفاده شد [54 و 55] . اندازه گیری های نوری در کانال بسته ( با استفاده از فیلتر دیجیتال ، با تحریک در nm479 و آشکارسازی در nm510 ) در انتهای هر مرحله انبساط ثبت شدند . تقریباً ng5-10 از DNA نوری به هر PCR اضافه شدند ؛ نمونه هایی بدون قالب DNA ای به عنوان کنترل های منفی در هر اجرای PCR وجود داشتند . کم ترین مقدار قالب های ژنومی که 2 ITS - می تواند از آن ها تقویت شود و سپس روی ژل agarose نمایان شود حدود pg 1 تا 2 تخمین زده شود (مثلا ً حدودا ً هم ارز 4 انگل )(نشان داده نشده است) . برای آزمایش کردن ویژگی cPCp 19 نمونه ی DNA ی کنترلی نیاز است که شامل DNA از مدفوع یا خون انسانی که سابقه عفونت انگلی نداشته باشد و DNA از باکتری Lactobacillus acidophilvs , Escherichiacoli و L. gasseri ، مخمر saaharomyces cerevisiae ، انگل های تک یا خته ای Giardia duodenalis و Entamoeba histolytica ؛ و کرم های انگلی S.mansoni ، Schistosoma japonicum ، Hymenolepis nana ، Taenia saginata ، T. solivan (کرم های پهن ) ، Ascaris sp ، Ancylostoma duodenale ، Necator americanus ، Strogyloides stercoralis ، oesophagostomum bifurcum ، Trichuris trichiura ( Nematoda) می شود که با این روش تقویت در ارتباطند . در ادامه ی PCR ، آنالیز منحنی ذوب امپلیکن ها که به وسیله افزایش دما از ℃65 به ℃80 با شیب متغیر افزایشی که از 0.2 شروع می شود در چرخاننده گرمایی هدایت می شوند (Rotor – Gene 6000) با تغییرات دما تغییرات در فلورانس ضبط شده و رسم می شود . آنالیز HRM با استفاده از نرم افزار 1.7.27 Rotor- Gene با متعادل سازی ناحیه های بین ℃15/65 - 65/65 و ℃50/79 – 00/80 و متوسط آستانه اطمینان حدود %90 انجام شد .
2.3 الکتروفورز ژل agarose ، پلی مرفی ترکیب یک طرفه (SSCP) و توالی DNA
شدت و کیفیت امپلیکن ها با استفاده از mM 65 از Tris-HCL T ، mM 27 از اسید برمیک ، mM 1 از اسید تترااستیک دیامین اتیلن (EDTA) ، (TBE) PH9 به عنوان بافر و یک استوانه bp100 به عنوان اندازه ساز ، روی برمید اتیدم %1.5 (w/v) که باژل های agarose بی رنگ شده ، آزمایش و بررسی شوند .
آنالیز SSCP غیر ایزوتوپی براساس روش B انجام شد (56) . امپلیکن های ITS-2 انتخاب شوند از روی ستون های کوچک پاک شده (wizard PCR prep) و در lμ 30 از شسته می شوند و سپس به ترتیب دهی خودکار مرتبط می شوند (BigDge chemistry , Applied Biosystems) و در هر دو مسیر ، از همان پریمرهایی که برای PCR استفاده شد (به طور جداگانه) استفاده می شود . علامت های توالی نوکلئوتیدی وقتی با جستجوهای تشابه پایگاه داده غیر زائد GenBank در ارتباط بود بدست آمد .
(NCBI Basic BLASTN ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BIAST )
3- نتایج . 3.10 : ویژگی پریمزها و شرایطPCR و امپلیکن ها
ویژگی مجموعه ایستر AP58SF – APITS – 2R و شرایط PCR برای توسعه محدوده ی ITS-2 با به کارگیری نمونه های مختلف DNA از خون یا مدفوع انسان (بدون اثری از عفونت انگلی) و نمونه های از محدوده ی ارگانیسم های پروکاریوتیک (باکتری) یا ایوکاریوتیک (مخمر ، تک یا فتگان ، trematodes ، cestodes و کرم های انگلی) و مراحل پیشرفته ای که در مجراهای روده ای یا مدفوع انسان اتفاق می افتد ، بنا شده است . کمترین مقدار DNA ژنومی c-parvum که با استفاده از مجموعه پریمز و به وسیله PCR قابل تقویت است ، در 1تا 2 صفحه تخمین زده شده بود که با تحقیق قبلی که با استفاده از منطقه ی کوتاهتری از ITS( به طور مشخص PITS-2 ؛ با میانجی گری ] 33[ . انجام شد سازگار بود . سپس ، ویژگی امپلیکن هایی که از نمونه های DNA ی ژنومی سوا شده ، استخراج شده اند و نمایانگر انگل های مجزا شده از c.hominis (3n=) و c-parvum (3n=) هستند ، بررسی شد . در ژل های agarose نوار دوتایی (حدود 440 و bp 450) و نوار تکی (حدود bp450) مرتبا ً و به ترتیب c.hominis و c-parvum را نشان دادند . برچسب های زنجیره (> bp 200) با استفاده از پریمزهای AP58SF یا APITS – 2R از بین همه ی امپلیکن های ITS-2 (مستقیما ً) معین شدند و مقایسه زنجیره اطلاعات با آن ها در پایگاه داده جاری (AJ539190، Aj 539200، AJ539216، AJ539217، AFO93011، AFO93012) هویت مشخص هر امپلیکن را تایید کرد .
3.2 . تشخیص تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی
با اثبات ویژگی ها، امپلیکن ها و شرایط PCR ، گام بعدی شناسای شخصیت ذوب امپلیکن های ITS-2 از c.hominis یا c-parvum بود . امپلیکن هایی که نشان دهنده نمونه های DNA ی کنترلی مرجع c.hominis (3 n= ؛ کدهای ch1 ، ch2 ، ch3 ) و c-parvum (3n= ؛ کدهای cp1 ، cp2 ، cp3 ) بودند ، در ابتدا برای برقراری سازگاری (تکرارپذیری) منحنی های ذوب برای نمونه ها در طول یک اجرا و در طول کل اجراها به کار گرفته شدند . (در پنج روز مختلف انجام شد .) ارزیابی دقیق تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی (کوواریانس) با محاسبه ی میانگین و کوواریانس دمای ذوب در طول 10 تکرار از هر یک از سه نمونه در یک اجرا و در طول پنج اجرا ، انجام شد . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضریب های سنجش داخلی تغییر (واریانس) برای اولین نقطه ای اوج ذوب 0.04 (ch1) ، 0.08 (ch2) ، 0.05(ch3) و برای دومین نقطه ذوب 0.06 (ch1) ، 0.10 (ch2) ، 0.09 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum ) ، ضرایب سنجش داخلی تغییر (واریانس) ، 0.11 (cp1) ، 0.01 (cp2) 0.02(cp3) بودند . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.14 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.15 (ch3) برای اولین نقطه ذوب و برای دومین نقطه اوج ذوب ،0.25 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.12 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.32 (cp1) ، 0.22 (cp2) 0.19(cp3) بودند .
شکل 1. منحنی های معرف در آنالیز منحنی ذوب امپلیکن های ITS-2 برای c.hominis (قرمز)،
c-parvum (آبی) یا c.meleagridis (سیاه) (بالایی) ، و منحنی های هنجار شده (نرمال شده) از همان اطلاعات (در پایین) .
جدول 1 . نتایج بدست آمده از DNA ژنومی از کریپتوسپوریدیای مجزا شده از انسان های مبتلا به کریپتوسپوریدیا به وسیله آنالیز منحنی ذوب جفت شده با PCR امپلیکن ITS-2 ، و تعدادی نمونه با منحنی خاص .
بنابراین ، ارزیابی های گسترده تغییرپذیری های سنجش داخلی ومیانی را به ترتیب <%1.5 و %3.5 نشان داد . 3.3 دسته بندی نمونه ها بر مبنای آنالیز منحنی ذوب : در ادامه ، همه ی نمونه های آزمایشی DNA ی کریپتوسپوریدیا مربوط به آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR بودند ( شکل 1 . cf) . دسته بندی خاص نمونه ها (جدول 1) با نتایجی که قبلا ً به وسیله ترتیب دهی جفت شده با SSCP ی SSU بدست آمده ، مطابقت داشت .] 30،31[ . در این تحقیق ، منحنی های ذوب به وسیله ی نقطه ی اوج های ℃0.33± 72.47 و ℃0.45 ± 74.19 (منحنی 1) ، ℃0.32 ± 72.17 (منحنی 2) و ℃0.03 ± 73.33 (منحنی 3) مشخص شدند (جدول 1) . امپلیکن هایی که از نمونه های منتخب برای نمایش منحنی 1 (کدهای 10 ch ، 48 ch ، 69 ch ، 93 ch ، 94 ch ) ، منحنی 2 ( کدهای (1cp ، 23cp ، 24cp ، 75cp ، 100cp ) ، و منحنی 3 ( کد 89 cm ) بودند ، به صورت تکه ای زنجیره ای ، و بر مبنای مقایسه با زنجیره های منتخب از پایگاه داده جاری (اعداد در دسترس AFO93012 ، AJ539190، AJ 539200، AJ539217، AJ539216 ، AFO93011، AFO381167) بودند ؛] 33،53،57[ ، به ترتیب برای نمایش c.hominis ، c-parvum و c.meleagridisنشان داده شده اند . وجود دو نقطه ی اوج در منحنی 2 ، به دلیل وجود دو گونه زنجیره اندازه ITS-2 (اختلاف در حدود bp 10) در امپلیکن ها خارج شده از c.hominis بود ؛ وجود دو نوع غالب توالی سازگار با یافته های مطالعه الکتروفورزی قبلی بود . ] 33[
برای هر یک از سه نوع کریپتوسپوریدیا ، منحنی فلورانس نرمال شده از آنالیز HRM (شکل 1 ، پایینی) ، که در آن کاهش تندی در فلوئورنس ثبت شد ، با منحنی ذوب مربوط به آن سازگار بود (شکل 1 ، بالایی) .
4. مباحث و نکات پایانی :
1 اندازه ی امپلیکن های ITS-2 (bp 450 -440) استفاده شده در آنالیزهای کنونی بزرگتر از آن هایی بودند که معمولا ً برای آنالیز منحنی ذوب استفاده می شدند ، بنابراین کاهش احتمالی ظرفیت آشکارسازی جهش وجود داشت ولی با این حال ، هویت مشخص و تفکیک نمونه ها به دست آمد . در واقع ، مطالعات مختلف نشان داده است ] 54-5-58-60[ که منحنی های ذوب دارای چند نقطه اوج ( مثل c.hominis ) می تواند تجدید پذیر باشد ]54[ و نمایش نقاط اوج مختلف مشخصا ً ، برای تهیه یک منحنی واحد با تعداد افزایشی کاراکترها برای تفکیک انواع و یا ژنوتیپ ها ، مفید است . برای مثال ، رابینسون و ... ]59[ آنالیز منحنی ذوب رابرای فرق گذاشتن بین هفت نوع Naegleria ( protista) ، و تفکیک از ارتباط با willaertia magna ، با استفاده از امپلیکن های منفرد ( حدود bp 400-330) که نشان دهنده ی ITS-1 ، S 5.8 ITS-2 , ی DNA ی هسته ای است ، استفاده کردند . به طور مشابه ، راسموسن (Rasmussen) و ... ] 60[ این روش را برای تفکیک c-parvumاز c.muris با استفاده از یک سازنده (حدود bp 300) در داخل SSU ی DNA ی هسته ای استفاده کردند . این مولف ها ، همچنین ، برنامه های کامپیوتری POLAND (http://www.biophys.uni – duessel dorf .de / local / POLAND / Poland . html ) و MELTSIM (http:// ftp. Bioinformatics.org/pub/meltsim ) را ارزیابی کردند و آن ها را برای پیش بینی کردن منحنی های ذوب که بر اساس اطلاعات زنجیره ای DNA می باشند ، مفید دانستند . در پیش بینی silico ، وقتی که برای محدوده ی ITS-2 از انواع کریپتوسپوریدیا به کار گرفته می شوند ، ممکن است محدودیتی وجود داشته باشد ، چون منحنی واقعی ذوب یک امپلیکن ITS-2 (از یک نوع یا انواع ) ، مخلوطی از محدوده های ذوب متعدد برای انواع مختلف زنجیره در یک امپلیکن را نشان می دهد ( ] 33[ را ببینید) . در آزمایشگاه ، یک منحنی مرکب ممکن است در ارتباط با تغییرات دقیقی با شد چون بعضی گرایشات در تقویت انواع زنجیره های انتخاب شده در PCR تحت شرایط خاصی است . به هر حال ، تهیه مکان هندسی در انواع منحصر به فرد ( و فراوانی انگل ها) به قدر کفایت همگن است .
در میان گونه ها در توالی مختلف است ، انتظار می رود روش مجازی ]60[ برای منحنی های ذوب پیش بینی شده برای گونه ها ی منحصر به فرد کریپتوسپوریدیا مفید باشد و حتی ممکن است در پیش بینی آنهایی که به عفونت های انواع درهم آمیخته وابسته اند ، کمک کند .
تعدادی از تحقیقات قبلی عفونت های درهم شده ی c.hominis ، c-parvum در انسان هایی که از روش های فنتیک (phonetic) استفاده کرده اند ، را گزارش کرده اند ( برای مثال : PCR بر مبنای پولیمورفیسم طولی تکه ای اعضاری یا PCR های خاص ] 61-67[ ) ولی در همه ی موارد ، وجود هر نوع در امپلیکن ها به وسیله زنجیره DNA مستقیم ثابت نشد . در تحقیق کنونی ، آنالیز منحنی ذوب وصل شده به PCR نمونه ها ( شکل 2) (بر مبنای آنالیز SSCP قبلی ) شامل بودن DNA ی c.hominis ، c-parvum و c.hominis + c-parvum را اثبات کرد و معلوم کرد که این روش ظرفیت آشکارسازی عفونت های مخلوط شده را دارد . به هر حال ، بر اساس یافته های منتشر نشده ، انتظار نمی رود که آنالیز منحنی ذوب حساسیت و دقتی را که SSCP برای آشکار سازی بصری هر دوی c.hominis ، c-parvum در نمونه ها دارد ، بدست بیاورد ( ]33 و 56[ را ببینید ) . این محدودیت پنهان ، ممکن است با اتصال کاربرد PCR پشت سر هم مرکب ]68[ یا PCR کاوشگر ]69[ به آنالیز HRM از بین برود . در پایان ، روش آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR کنونی برای نمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگل کریپتوسپوریدیا مناسب است . این روش ، اگرچه کیفی است ، علاوه بر روش های الکتروفورزی ]32-34[ مزیت های دیگری خصوصا ً در ارتباط با زمان آنالیز ، عملکرد نمونه ها و ذخیره اطلاعات و ظرفیت های آنالیز دارد . نیازی به ریختن ، جابه جایی و یا بررسی ژل های الکتروفورزی نیست ، بنابراین کاهش قابل توجهی در زمان و نوینه می باشد . همچنین ، منحنی ذوب به طور اتوماتیک ضبط شده و به صورت الکتونیکی ذخیره می شوند (به صورت صفحه های گسترده) و می توانند در هر زمان برای آنالیز های مقایسه ای بازیابی شوند . اگرچه روش کندی بر مبنای استفاده از یک نشان گر ژنتیکی است ، نشان گرهای دیگر (از 100 تا bp 450) تغییر زنجیره ها را نشان می دهند . که بین گونه ها بزرگتر از داخل گونه ها است و باید قابل استفاده برای گونه های مختلف کریپتوسپوردیا باشد . بنابراین ، آنالیز منحنی کنونی ، با به کارگیری نشان گر DNA ی کنونی ، باید ابزارهای کاربردی برای تشخیص ، بررسی شیوع عفونت های کریپتوسپوریدیا از مناطق جغرافیایی خاص و برای نمایش بروز کریپتوسپوریدیا تهیه کنند . اگرچه این روش برای تشخیص عفونت با c.hominis ، c-parvum یا c.meleagridis استفاده شد ، طراحی پریمرهایی که در خاصیت و وسعت به خوبی تغییر زنجیره در ITS-2 ]35[ باشند ، این گونه ها و گونه های دیگر کریپتوسپوریدیا را که از محدوده ی شکمی شامل آب ، غذا ، خاک و مدفوع مجزا باشند ، نشان می دهد ؛ این موضوع تحقیقات بیشتری را نیاز دارد . روش های مشابه آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR باید قابل اجرا برای محدوده ای از عامل های بیماری زای پروکاریوتیک و اِیوکاریوتیک کلیدی باشند ، در صورتیکه نشان گرهای DNA ی مناسب به کار برد .
شکل 2 : یک نمونه از آنالیز منحنی ذوب فرآورده های PCR منحصر به فرد که از DNA ی ژنومی (حدود 5 تا ng 10) هر یک از c.hominis (قرمز) ، c-parvum (آبی یا c-parvum + c.hominis (سبز) تولید شده است و از یک نمونه که از ترکیب (با نسبتهای مساوی) دو فرآوده که نشان دهنده c.hominis ، c-parvum (صورتی) است بدست می آید . امپلیکن ها مربوط به آنالیز پولی مورفیسم شکل بندی تک کرانه ای SSCP بودند که از قبل آنالیز منحنی ذوب بود ]33 و 37[ تا وجود نوارهایی که نشان دهنده ی هر دوی c.hominis ، c-parvum بود را در نمونه های گونه های مخلوط شده تخمین کند . (سبز و صورتی) .
قدردانی
تشکرهای صادقانه از Annkoehlor و سازمان بهداشت ، به دولت استرالیای جنوبی (برای تهیه بعضی نمونه هاکه در این جا استفاده شد .) و از امید نور محمدی برای دسترسی به چرخاننده گرمایی ، از Garry Anlerson برای تشریح مطالب و از Corbett life برای حمایت هایش . از سرمایه گذاری Melbourne Water Comporation ، the Australian Research Council (ARC) و American Fulbright commission - the Australian قدردانی می شود .
فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد
تعداد صفحات این مقاله 12 صفحه
پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید
دانلود مقاله بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها
